El gobierno de Irala puso el modelo para los asuntos interiores de Paraguay hasta la independencia. Además de los españoles, en Asunción también vivía gente proveniente de Francia, Italia, Alemania, Inglaterra y Portugal. Esta comunidad de aproximadamente 350 hombres escogieron como esposas y concubinas entre las mujeres guaraníes. Irala tenía varias concubinas aborígenes y animó a sus hombres para que se casaran con mujeres indias así se eliminaban las ganas de retorno a la madre patria. El Paraguay se erigió como tierra de mestizos rápidamente e incitado por el ejemplo de Irala, los europeos levantaron su descendencia como españoles. No obstante, las llegadas continuas de más europeos permitieron el desarrollo de una elite tipificada del criollo.

Los guaraníes, los kario, los tapé, los itatines, los guarajos y los tupi eran tribus que habitaron una inmensa área que comienza desde las regiones montañosas de las Guyanas cerca del Brasil hasta el río Uruguay. Los guaraníes siempre estaban rodeados por otras tribus hostiles por lo tanto frecuentemente andaban guerreando. Ellos creían que las esposas permanentes eran impropias para la conducta de un guerrero de modo que en algunas tribus practicaban la poligamia con el objetivo de aumentar el número de descendencia. Los caciques tenían a menudo veinte o treinta concubinas, las cuales ellos compartían libremente con visitantes ocasionales. Esos jefes trataban bien a sus esposas oficiales pero no dudaban en castigar a menudo a las adúlteras con la muerte. Vale aquí la siguiente observación: como eran polígamos, tal vez los españoles se sintieron alentados a seguir tal norma de vida. Y como compartían las mujeres, los indios se vieron diezmados posteriormente por la sífilis, enfermedad desconocida en América e importada por los conquistadores. De esa manera los guaraníes puros se vieron reducidos numéricamente en el transcurso de los años.

Como las otras tribus de la zona, los guaraníes eran caníbales. Pero ellos normalmente comían sólo a sus enemigos más valientes capturados en batalla con la esperanza de adquirir la valentía y poder de sus víctimas.

En contraste con el guaraní hospitalario, las tribus de Chaco, como los payaguás (de donde provenía el nombre Paraguay según una de las varias versiones sobre el origen del nombre del país), los guaycurúes, los m'bayá, los abipones, los mocovíes y los chiriguanos eran enemigos implacables de los blancos. Los viajeros en el Chaco narraban que los indios eran capaces de aprender rápidamente el uso de los caballos (animales de origen europeo) para ganar guerras. Los guaraníes aceptaron la llegada de los españoles y los buscaban para protección contra las tribus feroces vecinas pero también esperaron que los hispánicos los llevaran una vez más a una lucha contra el Inca.

La paz que había prevalecido bajo Irala se arruinó en 1542 cuando Carlos V nombró a Alvar Nuñez Cabeza de Vaca, uno de los conquistadores más famosos de su época, como gobernador de la provincia. Cabeza de Vaca llegó a Asunción después de haber vivido durante diez años entre los indios de la Florida (Norteamérica). Casi inmediatamente, la provincia del Río de la Plata con 800 europeos como elite se escindió en dos facciones antagonizantes y belicosas. Los enemigos de Cabeza de Vaca lo acusaron de opositor de los intereses de los indios y de autoritario recalcitrante. Éste intentó aplacar a sus enemigos lanzando una expedición en el Chaco en busca de una ruta a Perú. Este movimiento molestó enormemente a las tribus del Chaco tanto que ellos iniciaron una guerra de dos años de duración contra la colonia y amenazaron virtualmente su propia existencia. En la primera de las innumerables revueltas de la colonia contra la Corona, los colonos arrestaron a Cabeza de Vaca, lo enviaron a España cargadísimo de cadenas y le devolvieron el gobierno a Irala. En medio de ese fragor, la comunidad colonial se dividió entre "leales" (a la Corona) y "comuneros", éstos últimos llamados así en honor a los comuneros castellanos caídos ante Carlos V en defensa de sus derechos populares contra los privilegios reales.

Irala gobernó extensamente y sin interrupción hasta su muerte en 1556. En muchos aspectos, su gobierno era uno de los más humanos en el Nuevo Mundo español en ese momento y marcó la transición de los conquistadores a los hacendados en la colonia. Irala mantuvo relaciones óptimas con el pueblo guaraní, con los indios antaño hostiles luego pacificados, hizo exploraciones al Chaco y dio inicio a las relaciones comerciales con el Perú. Ese vasco soldado de fortuna fue el que originó los principios de una industria textil y la introducción de ganado que floreció en las colinas fecundas y prados del país. La llegada del padre Pedro Fernández de la Torre el 2 de abril de 1556, como el primer obispo de Asunción marcó en Paraguay el establecimiento de la Iglesia Católica. Irala también fue testigo de la construcción de una catedral, dos iglesias, tres conventos y dos escuelas.

Irala antagonizó a los indios de todas formas. En los últimos años de su vida, se rindió ante las presiones de los colonos y estableció la encomienda. Bajo este sistema, los colonos recibieron tierras a modo de propiedad  junto con el derecho a la labor y producción de los indios que vivían en esas propiedades. Aunque se esperaba que los encomenderos satisfagan las necesidades espirituales y materiales de los indios, el sistema se degeneró rápidamente en una virtual esclavitud. En Paraguay 20.000 indios eran divididos entre 320 encomenderos. Esta acción chispoteó una revuelta india muy grande en 1560 y 1561. La inestabilidad política preocupó a la colonia y las revueltas eran moneda corriente. Además con recursos y milicia limitados, Irala poco pudo controlar las correrías de merodeadores portugueses a lo largo de las fronteras orientales. Aun así Irala dejó el Paraguay próspero y relativamente en paz. Aunque no había encontrado ningún El Dorado para empatar los hallazgos de Hernán Cortés en México y los de Pizarro en Perú, fue amado por su pueblo quien lamentó su muerte.